普通菜豆抗炭疽病基因鉴定与分子标记

赵晓彦，王晓鸣，朱振东，王述民

（中国农业科学院作物科学研究所，北京  100081）

摘  要：菜豆炭疽病是世界菜豆生产中的主要病害之一，使菜豆产量和品质受到严重影响，对抗炭疽病基因的研究可以为培育抗炭疽病品种奠定基础。菜豆炭疽病病菌生理分化比较复杂，由于菜豆品种的抗病性不同和地域不同，菜豆炭疽菌的致病性分化不同。10个已知抗炭疽病基因中，9个基因（Co-1，Co-2，Co-3/Co-9，Co-4²，Co-5，Co-6，Co-7，Co-10）已被确认为独立显性基因, 其中Co-3/Co-9是等位基因；Co-1, Co-4和Co-9存在等位基因， co-8为隐性基因。除Co-5,Co-7和co-8三个基因还没有被定位外，其他基因被定位在不同的连锁群上。

关键词：普通菜豆；炭疽病；抗病基因；分子标记

Genotypic Identification and Molecular Marker for the Resistance Genes to Anthracnose in Common Bean

ZHAO Xiao-yan，WANG Xiao-ming，ZHU Zhen-dong，WANG Shu-min

(Institute of Crop Sciences，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081)

Abstract：Anthracnose（Colletotrichum lindemuthianum）is regarded as one of the most devastating diseases of common bean throughout the world. It causes greater losses to the production and quality of common bean. The study on the gene resistance to anthracnose can supply a foundation for resistance breeding. Gene resistance to anthracnose in common bean is Co-1 to Co-10 among which nine are independent and Co-3/Co-9 is allelic. Except the recessive co-8 gene, all other nine are dominant genes and multiple alleles exist at Co-1,Co-4 and Co-9 loci. Except loci Co-5,Co-7 and co-8,all other genes are mapped to different linkage groups.

Key words：Common bean；Anthracnose；Resistance gene；Molecular marker

表型鉴定是作物各类性状鉴定与评价的基础，在作物种质资源研究中具有重要地位。但由于许多性状的表型鉴定易受环境条件影响，特别是在不同年份、不同批次的鉴定中有时会产生误差，一些材料的真实基因型无法得到有效和真实的表达，因而表型鉴定具有一定的局限性；同时，在抗病性鉴定中，一次接种病原菌小种只能鉴别出一个抗病基因（在基因-基因互作体系中），若要鉴别不同的抗病基因，则需要一系列不同毒性的病原菌小种，鉴定工作量很大，耗时较长，环境和操作带来的误差也会加大。随着分子生物技术的迅速发展，国内外许多学者正致力于植物抗病基因的分子标记鉴定、定位、克隆及抗病机制等分子生物学研究。通过寻找与抗病基因紧密连锁的分子标记，为分子标记辅助育种奠定基础，缩短抗病育种年限，提高效率。菜豆炭疽病是世界菜豆生产中的主要病害之一，严重影响菜豆产量和品质，中国菜豆产区均有发生。通过抗病性鉴定得到的抗炭疽病的菜豆种质资源,利用分子标记技术可以从基因角度阐明抗病种质的抗病基因类型。

1        普通菜豆生产

普通菜豆（Phaseolus vulgaris L.）又名四季豆、芸豆、饭豆，英文名为Common bean或Haricot bean。染色体2n=22。分类上属豆科（Leguminosae），蝶形花亚科（Papilionoideae），菜豆族（Phaseoleae），菜豆属（Phaseolus），菜豆种。一年生短日性草本植物，喜温暖，不耐霜冻，生育期短，一般品种需无 霜期105～120d。普通菜豆含有丰富的营养成分，富含碳水化合物、蛋白质、矿物质、多种维生素和8 种人体所必需的氨基酸，既可作为粮食（粒用菜豆品种）又可作为蔬菜（食荚菜豆品种），个别品种还有药用价值^[1]。对我国部分普通菜豆种质资源分析结果表明，籽粒含蛋白质15.2％～29.0％，脂肪0.69％～1.44％，淀粉34.6％～51.5％，并含有各种矿物质 ^[2,3]。

普通菜豆起源于中南美洲，中国为次级起源中心。据联合国粮食与农业组织的统计（FAO，2004年）全世界普通菜豆的总面积为26 364 754hm²,总产量为18 387 524t，中国普通菜豆总面积为805 000 hm² ,总产量为1 759 000t，总产量高的国家依次为巴西、印度、中国、缅甸、墨西哥、美国、乌干达、肯尼亚、印尼等。普通菜豆在我国各省均有栽培，主产区分布在黑龙江、内蒙古、山西、陕西、贵州、云南等省^[4,5]。

2        菜豆炭疽病

菜豆炭疽病是由菜豆炭疽菌（Colletotrichum lindemuthianum(Sacc.et Magn.)Br.et Cav.）引起的一种真菌性病害。1875年在德国初次报道，世界各地菜豆产区均有发生。由于病害发生期长，菜豆产量和品质同时受到严重影响，一般减产20％～30％,重者绝产。中国是世界上重要的菜豆生产国之一, 菜豆炭疽病发生地区广泛,危害严重。已有炭疽病发生的地区包括北京、天津、河北、内蒙古、山西、辽宁、吉林、黑龙江、江苏、浙江、福建、江西、河南、湖南、广东、广西、四川、云南、陕西、台湾等。

2.1  病症

病菌侵染菜豆叶片、荚、茎。叶部病斑多发生在叶背的叶脉上，沿叶脉扩展成小条斑，深褐色。荚上病斑初为长圆形，暗褐色，后期病斑中部凹陷，边缘褐色，空气潮湿时，病斑上布满砖红色分生孢子，在多雨、多露、多雾冷凉多湿地区，种植过密、土壤粘重下湿地发病重。

2.2  病菌生理特性

病菌菌丝体生长温度范围为14～27℃，最适为21～23℃，30℃以上和6℃以下均不适于生长，分生孢子在45℃条件下经10min致死。

2.3  病菌的生理分化

菜豆炭疽病病菌生理分化比较复杂，不同国家和地区的小种类型差异较大，鉴定研究采用的鉴别寄主除有国际通用的品种外，还有各自选用的品种，因此比较不同国家间生理小种研究结果较为困难。在国际上较早采用的生理小种鉴别寄主为7个菜豆品种：Michigen dark red kidney（MDRK），Widusa，Kaboon，Michelite，Sanilac，Prelude，Cornell 49-242等，并根据在鉴别寄主上的抗感反应类型以希腊字母命名小种；经1988年菜豆炭疽病国际研讨会上不同国家学者的讨论，建议采用含有不同抗炭疽病菌基因的菜豆品种作为国际统一的菜豆炭疽病病原菌生理分化鉴定的鉴别寄主，同时生理小种的命名采用二进制法。这套统一的鉴别寄主包括12个品种：Michelite，Michigen dark red kidney(MDRK)，Perry Marrow，Cornell 49-242，Widusa，Kaboon，Mexico 222，PI 207262，TO，TU，AB136，G2333。统一的国际鉴别寄主中分别含有单一或多个不同的抗炭疽病基因，并有固定的小种命名（表1）。

表1    国际热带农业中心（CIAT）对12个鉴别品种中所含有的抗炭疽病基因分析^[6]

Table 1  The gene resistance to anthracnose in twelve indentification varieties from CIAT

MA表明来源于中美洲地区；A表明来源于安第斯(Andean)山区；小种命名为二进制命名法

MA=Middle American gene pool,A=Andean gene pool of the host

Binary number:for 2n,n is equivalent to the place of the differential cultivar within the series.

Menezes^[7]用12个鉴别寄主对巴西的201个病菌分离物进行鉴定，确立了9个生理小种a,d,e,k,l,z,h,q,m。Alam^[8]确定了原西德有b,g,d,k 和 l 5个生理小种，优势小种为致病性强的d,k和l。并根据在12个鉴别寄主上的不同反应将b, d 和l 进一步划分为 b1d,b1e,b2e,d1,d2,l1和l2。Fernandez^[9]用12个鉴别寄主对60个病菌分离物进行了鉴定，确定了在西班牙北部g小种的存在，另外一个新的小种被确定为 d-mutant。并根据二进制命名法确定g小种为小种38，d-mutant小种为小种7。王晓鸣用12个鉴别寄主对53个中国病菌分离物进行鉴定，鉴别出的11个生理小种，除17、81和119小种国外已有报道，其余8个小种均为中国特有，表明中国菜豆炭疽菌的致病性分化有其独特的路线^[10]。

2.4  病菌培养、接种和品种抗性评价

病菌在MA培养基上于23℃黑暗下培养15d，收集菌落中产生的分生孢子并配置浓度为2×10 ⁶孢子/ml的接种液。在菜豆第一片真叶展开时喷雾接种，然后保湿2d，充分发病后调查。单株抗感分级以6级划分^[11]，以0、1、3级为抗病，5、7、9级为感病。

2.5  菜豆抗炭疽病基因

菜豆抗病性与菜豆炭疽菌致病性之间的关系属于典型的“基因—基因” 互作类型，即病菌存在显著的生理小种分化，病菌的1个无毒基因对应寄主的1个抗病基因；一旦新的致病基因形成，原有的抗病基因即失去抗性作用。

对鉴别寄主中所含抗炭疽病基因的研究表明（见表1），在12个鉴别寄主中分别含有不同的抗炭疽病基因或基因组合。Michelite 不含抗病基因，其他抗病基因的载体品种为：Co-1(MDRK), Co-1² (Kaboon), Co-1³ (Perry Marrow, Widusa), Co-2 (Cornell 49-242), Co-3 (Mexico 222), Co-4 (TO), Co-4² (SEL1308), Co-4³ 和 Co-9 (PI 207262) ,Co-5(SEL1360) ,Co-6 (AB 136),新的抗病基因Co-10载体品种是 Ouro Negro^[12]。对这些抗炭疽病基因的遗传学研究证明，已发现的这些基因中多数属于显性遗传且已有明确的染色体定位。这些重要的研究为炭疽菌生理小种命名提供了科学依据，也为新抗病基因的鉴定提供了重要信息。

3        菜豆抗炭疽病基因的分子标记研究

3.1  10个已知基因的鉴定与标记研究

10个已知抗炭疽病基因中，9个基因（Co-1，Co-2，Co-3/ Co-9，Co-4²，Co-5，Co-6，Co-7，Co-10）已被确认为独立显性基因^[12～19], Co-3/Co-9是等位基因，co-8为隐性基因^[12]。

关于Co-3/Co-9是等位基因有两个依据：⑴等位性检测和遗传连锁分析表明Co-9基因在B4染色体的 Co-3位点^[20]。⑵对 Chaucha Chuga 有毒性的25个炭疽菌生理小种与对Co-3有毒性的小种相似，在Chaucha Chuga中发现3个QTL控制对炭疽菌的抗性在B4上并且一个与以前定位的Co-9位置相同^[21] 。

除了Co-5,Co-7,co-8三个基因还没有被定位，其他基因已被定位在不同的染色体上，虽然Co-3/Co-9和Co-10都定位在B4但它们并不连锁。在Co-1,Co-4和Co-9位点上有等位基因已有明确报道：Co-1(MDRK), Co-1² (Kaboon), Co-1³ (Perry Marrow, Widusa), Co-1⁴ (AND277)^[12], Co-1⁵ (Widusa)^[22]. Co-4 (TO), Co-4² (SEL1308)^[19], Co-4³ (PI 207262)^[23]. Co-9 (PI 207262), Co-9 ² (BAT93), Co-9 ³ (Widusa) . C o-1定位在B1染色体，Co-2定位在B11染色体，Co-3在B4染色体，Co-4在B8，Co-6在B7，Co-9、Co-10在B4^[24～26]。

G 2333菜豆品种含有Co-4²，Co-5，Co-7^[22]3个抗炭疽病基因 ，这3个基因共同作用使G 2333能够抵抗所有炭疽菌生理小种，G 2333具有100％抗性^[27]。

Geffry.V^[24]等在Co-2的RAPD标记ROH20基础上设计了PvH20引物^,将PvH20作为探针鉴定菜豆品种中的Co-2基因。Ronman Xavier Corrêa^[28]等用抗锈病基因Ouro Negro的SCAR标记SF10 ₁₀₇₂ 、SBA8 ₅₃₀ 来选择带有Ouro Negro基因的个体。Ouro Negro的RAPD标记与Ouro Negro基因的遗传距离为2.1±1.5 cM。SCAR标记SCF10(抗锈病标记)与Co-10距离为12.3cM ^[29]，用SCF10标记可以同时筛选含抗锈病基因和抗炭疽病基因Co-10的品种^[30]。

Azucena et al. ^[31]发现菜豆品种A193对炭疽菌毒力最强的小种1472有抗性，A193与感病品种Flor de Mayo Bajio杂交，在F2发生性状分离，说明A193对1472小种的抗性是由单一的显性基因控制。A193与Perry Marrow杂交，A193与Michigan Dark Red Kidney 杂交， F2代100个个体中没有被1472小种感染的个体，表明A193中的抗性基因为Co-1。

3.2  抗炭疽病基因的标记引物序列

迄今，已在菜豆中对10个已知抗炭疽病基因中的8个基因成功进行了分子标记，其中5个获得了SCAR标记( Co-2, Co-4², Co-5, Co-9, Co-10 )（表2），3个为RAPD标记（Co-1、Co-6、co-8），而Co-3和Co-7未见标记研究报道。

表2    已知抗炭疽病基因的SCAR引物序列

Table 2  The sequence of SCAR primers of the marker linking to the resistance genes to anthracnose`

表３　　　已知抗炭疽病基因的RAPD引物序列

Table 3  The sequence of RAPD primer of the marker linking to the resistance genes to anthracnose

3.3  抗病基因标记的主要方法

植物病害是农业生产的主要限制因子之一。人类克服植物病害的主要途径之一是利用抗性资源, 通过常规育种的方法培育抗病品种。但由于植物抗病性的复杂性以及人们对植物与病原物互作机制认识的匮乏, 再加上常规育种途径本身的局限性, 抗病育种一直是农业生产上的重大难题^[32]。分子生物技术的迅速发展为植物遗传育种提供了多种基于DNA多态性的分子标记，如RAPD、RFLP、AFLP、SSR、STS、CAPS、 SCAR、RGLM、QTL等可以迅速提供与目标性状相关的分子标记。通过寻找与目的基因紧密连锁的分子标记可以直接或间接定位目的基因，加快抗病育种进程。目前在抗病基因分子标记中应用较多的主要有三种标记：随机扩增多态性（Random Amplified Polymorphic DNA，缩写RAPD）、简单重复序列DNA（Simple Sequence Repeat Polymorphisms, 缩写SSRP,通常又称为SSR）和序列特异扩增区域（Sequence-Characterizd Amplified Regions，缩写SCAR）。目前SSR标记已被广泛应用于资源鉴定、连锁图绘制及目标性状基因的标记等研究上^[33],。SCAR标记是在RAPD技术的基础上发展起来的，基本步骤是先作RAPD分析，然后把目标RAPD片断进行克隆和测序，根据原RAPD片段的序列设计特定的一组引物，设计引物一般比RAPD引物长，通常24个碱基。利用设计引物进行PCR专化扩增，可将原RAPD片断中的特定DNA区域扩增出来。这样的位点称为SCAR。目前SCAR标记技术已用于对RAPD、AFLP、SSR等标记获得片段的进一步利用中。由于SCAR标记具有更高的可重复性和共显性等特点，因此比RAPD和其他利用随机引物扩增的方法在基因定位和作图方面更具有优势。由表2和表3可以看出，5个菜豆抗炭疽病基因已有SCAR标记，3个菜豆抗炭疽病基因已有RAPD标记。关于普通菜豆抗炭疽病基因SSR 分子标记正在研究，还未见报道。

4  讨论

在1986年至2000年间，通过国家科技项目的支持，已对我国粒用菜豆（Dry bean）种质资源和菜用菜豆（Green bean）种质资源进行了抗炭疽病鉴定，其中，利用我国普遍分布的菜豆炭疽菌生理小种α(CllG-07)鉴定了来自北京、河北、内蒙古、吉林、黑龙江、四川、贵州、云南、陕西等省（自治区、直辖市）1655份及引进的粒用菜豆资源61份，发现了对菜豆炭疽病表现中抗～高抗的种质资源210份。限于当时的研究条件，仅用1个病菌生理小种进行了接种鉴定，因此这些抗病种质资源可能含有抗该生理小种的基因^[34,10]。中国是菜豆的次生发源地，生态类型多，菜豆资源变异丰富；中国菜豆炭疽菌的生理分化与国外相比有较大差异，因此在长期的寄主进化和与病原菌的互作中，有可能存在抗病基因的变异。目前，对已鉴定出的抗炭疽病种质资源所含有的抗病基因型尚不明确，限制了抗炭疽病资源在抗病育种中的利用。因此，利用现代分子标记技术，对获得的具有突出抗性的菜豆种质资源进行抗病基因型鉴定，将可以从基因角度阐明不同种质资源的抗病基因类型，为进一步利用不同抗病基因提供材料，为抗病育种提供技术。

   菜豆的主要病害有菜豆炭疽病（Anthracnose）、菜豆花叶病毒病（Bean Common Mosaic）、菜豆黄花叶病毒病(Bean Golden Mosaic)、菜豆锈病（Rust）、菜豆细菌疫病（Bacterial Blight）、菜豆角斑病（Angular leaf spot）等，这些病害的抗病基因都已经有分子标记报道。目前分子标记技术作为育种工作的辅助手段，已经取得了显著的成就。由于有的标记与目的基因的距离太远，所以分子标记不能作为基因型鉴定唯一工具，需要进一步借助常规方法如基因推导法和抗病性鉴定进行验证，需要寻找与目的基因更近的标记。并且不同的分子标记方法各有优缺点，如果将RAPD标记的转化为SCAR标记，这样比较稳定。现在关于普通菜豆抗炭疽病基因的SSR标记还没有报道，因此发掘它的SSR标记也是目前的一个目标。

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