植物基因功能鉴定新工具-病毒诱导基因沉默技术的研究进展

张增艳，姚乌兰，辛志勇

（农作物基因资源与改良国家重大科学工程，农业部遗传育种重点实验室/中国农业科学院作物科学研究所，

北京100081）

 

摘要：病毒诱导基因沉默（Virus-induced gene silencing，VIGS）技术是指带一段靶基因序列的VIGS重组病毒侵染植物、引起植物同源基因沉默与表型变异，进而通过表型变异进行基因功能分析的方法，是近年发展起来的从反向遗传学方向快速鉴定植物基因功能的技术，是转录后基因沉默机制的一种表现。本文从以下几方面进行综述：①VIGS的分子机制，涉及基因沉默的起始、维持和信号放大、传播共3个阶段；②VIGS技术、载体与方法学的发展；③VIGS作为基因功能研究的优越性，如不必进行转基因、操作方法简便、获得结果快速等；④应用VIGS对植物抗病途径、代谢与发育调控中参与基因功能进行研究的概况。同时，展望了VIGS技术作为植物功能基因组学功能分析的高通量技术平台的美好前景。

关键词：病毒诱导基因沉默；基因功能分析；病毒载体

Advances on Virus-induced Gene Silencing for Gene Function Characterization in Plants

ZHANG Zeng-yan, YAO Wu-lan, XIN Zhi-yong

(Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, The State Key Science Engineering of Crop Germplasms and Gene Improvement，Key Lab of Crop Genetics and Breeding， Ministry of Agriculture， Beijing 100081)

Abstract：Virus-induced gene silencing（VIGS） is a recently developed technique of gene transcript suppression for characterizing gene functions of plants in reverse genetics, which involves a virus delivery vector carrying a short sequence of a targeted gene infect a young plant, and in a few weeks natural defense mechanisms of the plant result in silencing of the targeted gene. It is a kind of post-transcriptional gene silencing. The reviews introduced the follows: ①a positive molecular mechanism involved in VIGS, including the silencing initiation, maintenance, and signal amplification and dissemination; ②developments of VIGS technique including VIGS vectors and methodology; ③advantages of VIGS over other approaches, such as T-DNA or transposon tagging, including the circumvention of plant transformation, methodological simplicity and speedy results. ④studying the roles of genes involved in plant defense responses，metabolic and development. The review provides the prospects for VIGS as a powerful and high-through tool for assessing and characterizing the function in plant function genomics .

Key words: Virus-induced gene silencing；Gene function characterization；Virus vector

随着各种文库构建、测序和基因克隆等技术的发展和完善，植物基因组序列与序列表达标签（Expressed sequence tags，EST）和分离的候选基因的数量正在迅猛增加，为阐明这些序列及基因的生物学功能，迫切需要将序列信息转化为功能信息，对靶序列进行功能分析的快捷、高通量的工具。

利用转基因获得功能（Gain-of-function）法以及T-DNA与转座子突变等基因敲除(Loss-of function)方法，在候选基因功能研究方面扮演着非常重要的角色，然而它们依赖于植物转基因完善程度、稳定的转基因株系的获得或大量突变体的创造和鉴定，不仅工作量大、周期长、效率低，费时、费力，难以对大量基因的功能进行高通量的分析。而病毒诱导基因沉默（Virus-induced gene silencing,VIGS）技术则能克服上述不足，有望成为快速、高通量分析植物基因功能的技术平台。

VIGS技术是指携带一段靶基因表达序列的VIGS重组病毒侵染植物、引起植物内同源基因沉默与表型变异，进而通过表型变异进行基因功能分析的方法[1，2]。

1  VIGS的分子机制

    VIGS是利用植物对病毒的天然防御机制发展的瞬时、快速鉴定植物基因功能的技术，为从基因序列到功能的反义遗传学方法，也是转录后基因沉默（Post-transcript gene silencing，PTGS）、RNA沉默机制的一种表现，相似于线虫的RNA干扰。

已在真菌、植物和动物的许多物种中发现了PTGS过程的同源基因和酶，因此认为 PTGS机制在整个生物进化过程中是很保守的[3]。目前关于基因沉默的假说认为，PTGS包括三个阶段：起始、维持和信号放大与传播[3,4]。双链RNA（dsRNA）是基因沉默的起始因子。第一阶段包括dsRNA的形成，识别和小干扰RNA（siRNAs）片段的产生，由RNA病毒复制机制、源于转基因的双向克隆形成的发夹RNA（hpRNA）和反义RNA（asRNA）克隆技术均可产生dsRNA；dsRNA被识别并被Dicer酶从两端降解成21~23核苷酸的siRNA。在维持期，siRNA与RNA酶形成复合体即RNA诱导沉默复合体（RISC），后者具有RNA同源性寻找活性和解旋酶活性、以解旋dsRNA，该复合物可被解旋的siRNA激活，鉴别单链siRNA序列和降解互补的转录产物。在第三阶段，上述形成的siRNA作为信号被鉴别，在RdRp引导下，siRNA作为dsRNA扩增的诱发子并以ssRNA作摸板，将沉默反应放大、增强，在这个过程中，siRNA可能作为一种信号分子在植株中系统传播，诱导更多细胞启动PTGS，进一步放大了PTGS效应[5]。

一些研究显示PTGS的信号分子可以进行短距离和长距离的运动，PTGS在植物体内短距离的细胞间传导是通过胞间连丝进行的，而长距离的传导则是通过植物的韧皮部进行的，并且PTGS的信号也可以利用植物体内RNA的转运网络进行系统传导。

当植物病毒基因组中引入一段寄主基因片段构成重组病毒，后者侵染寄主细胞后，会激活这种植物对病毒的防御机制，表现出目标基因的功能丧失或表达活性下降的表型，进而可根据表型变化鉴定目标基因的功能。如当载体中插入片段是抗病必需基因时，VIGS后植物就降低了对病原的抗性、甚至丧失抗病性。

    1995年Kumagai等[6]，1998年Ruiz等[7]以及kjemtrup等[8]分别利用带有特定基因片段的不同病毒载体侵染本氏烟，导致了特定目标基因的沉默，开创了应用VIGS技术研究植物基因功能的先河。

2  VIGS技术的发展

2.1 VIGS载体的发展

    第一个 VIGS载体是由模式RNA病毒烟草花叶病毒（TMV）发展的。1995年Kumagai等在TMV上插入了一段PDS基因的部分序列，侵染本氏烟后成功地诱导了PDS基因的沉默[6]。PDS即八氢番茄红素脱氢酶是类胡卜素合成所必需的酶,具保护叶绿素免受光漂白的作用，而PDS基因发生沉默，被侵染植物就会表现出光漂白症状。PDS表型变异易于辨别，因此PDS基因成为VIGS体系评价的参照基因。1998年由DNA病毒番茄金色花叶病毒（TGMV）发展的VIGS载体，在本氏烟上成功地诱导了镁离子螯合酶的关键基因Su和转基因luc荧光蛋白基因发生沉默[8]，但TGMV载体诱导基因沉默的效率较低。1998年Ruiz等[7]以马铃薯X病毒（PVX）作载体，实现了本氏烟PDS基因沉默。PVX载体的最大优点是比TMV载体更稳定，但PVX侵染寄主范围窄。TMV、PVX、TGMV能在接种植株上引起病症，难以解释一些精细的PTGS现象，而且不能侵染分生组织、影响其应用范围。2001年由烟草脆裂病毒（TRV）发展的载体，诱导基因沉默的效率、持久性均优于上述载体[9]，只引起温和的病症，而且能侵染分生组织和花，已广泛用于研究烟草、番茄与马铃薯等多个基因的功能[2]。Gossele等[10]将伴随TMVU2的卫星病毒（STMV）基因组改造、可插入外源片段，由TMV辅助病毒提供复制和运动的蛋白，能有效地抑制PDS等基因的表达并呈现明显的表型突变。Tao等[11]建立了基于中国番茄黄化曲叶病毒（TYLCCNV）卫星DNA β分子的DNA卫星载体，既可以有效地抑制转基因GFP的表达，也可高效抑制内源基因PDS和Su的表达。2002年Turnage 等[12]利用大白菜曲叶病毒（cbLCV）在拟南芥上建立了VIGS体系。Holberg等 [13]利用大麦条纹花叶病毒（BSMV）首次在单子叶植物大麦上成功抑制了PDS基因的表达；随后Lacomme等[14]分别对BSMV病毒进行改造，以提高VIGS表型效应。本课题组用BSMV作载体在小麦上实现PDS的VIGS[15]，为快速分析小麦基因功能展示了诱人的前景。

VIGS必须依赖于病毒载体在寄主植物上建立有效的VIGS体系。迄今，VIGS体系在烟草上最稳定和应用得最成功。主要原因可能是烟草胞间连丝对病毒的排阻、限制要比其它植物小,也可能是多种病毒可侵染烟草、且这种植物在限制病毒积累的正常防御成分上存在一定的缺陷。

2.2 VIGS方法学

    由于VIGS使用的载体是遗传修饰的病毒，VIGS的应用存在一定的复杂性，必须在严格的环境条件下操作，应该考虑以下几个因素[2]。

2.2.1 VIGS载体的插入片段  关于载体中插入片段应该考虑以下因素：首先是长度，插入基因序列大小的上限取决于病毒在植物细胞间运动的限制，而且在病毒间与植物物种间也可能有所不同。在本氏烟中，PVX和TRV载体上插入的基因序列长度上限均为1.5Kb，此限以上，病毒可能不能传播而高比例地丧失插入片段，影响沉默效果，23bp是基因沉默的下限，但大于23bp 的序列应产生更有效的沉默，一般采用150~500 bp的片段，以保证有效沉默。二是选择靶基因的哪段序列作插入片段。VIGS效果是基于序列同源性：同源性越高，基因沉默效果越好，85%以上的同源性即可引起有效的基因沉默[6,13]。沉默的靶基因序列必须认真选择，可通过Blast search 等方法分析被抑制的基因是否为基因家庭的成员。对于单拷贝基因，其ORF的任一区域应该都可用于沉默，但如拟沉默某一家族的某基因，必须认真选择非保守区域或非转录区（UTR）序列来区别具高度保守ORFs间基因，反之选择高度保守区可共抑制基因家庭的几个成员，克服可能的功能重复[2,16]。

    已建立的含Gateway克隆位点的病毒载体（Invitrogen公司），并允许有效亚克隆ESTs文库中大量cDNAs序列[16]，用于大规模表达序列的功能分析和文库筛选。随着VIGS技术的成熟度继续增加，VIGS可能会同时抑制多个不同基因的表达，以阐明它们的动态关系。目前正用反义方法进行腺体生物合成的研究。

2.2.2接种技术  最初，以线性化的质粒DNA为模板进行体外转录，然后以侵染性的RNA形式、通过摩擦法接种植株幼叶，可采用该方法研究少数基因功能，但该方法接种不仅费时，而且结果不稳定。此后发展了农杆菌介导法，T-DNA中插入全长的病毒cDNA，在CaMV35S启动子控制下，通过农杆菌介导法使病毒侵染植物细胞，与体外转录法相比该方法操作成本更低廉，更适合进行高通量的基因鉴定[2]。根据植物的种类和实验类型，发展了用农杆菌接种的不同方法，以PVX作VIGS载体，可用牙签沾取农杆菌，然后将牙签刺入烟草幼叶中，该方法适用于高通量的筛选。然而牙签法对于TRV在番茄上传染效果不好，因此必须用注射器压滤，真空泵压滤或用农杆菌液喷雾幼苗才能获得良好的沉默效果。当VIGS用于其它植物时，必须选择农杆菌菌株和优化接种技术，但对于单子叶植物农杆菌介导法尚未成功。

2.2.3影响VIGS的环境因素  成功的基因沉默依赖于病毒传播和植物生长间相互作用的动力学，其中任一因素均受环境条件的影响，温度是病毒传播和基因有效沉默的最重要影响因素之一，TRV在番茄上建立良好的沉默表型是在温度21℃或21℃以下产生的，而TRV在本氏烟上产生沉默的适宜温度为25℃左右，25~29℃是BSMV在大麦上诱导基因沉默的适宜温度[13]。生长箱可较好地保持VIGS实验的沉默重演性。

2.2.4 VIGS实验的对照与沉默效率的评价  在VIGS实验中设立适合的对照非常关键。为监检沉默效率，通用的阳性对照为PDS基因的沉默，为排除病毒载体自身可能引起的表型干扰，有必要用空载体病毒接种植物作为阴性对照，另一个内在阳性对照是用一个功能明确的内源基因序列插入病毒载体接种植物。

    RT-PCR分析可确定VIGS的沉默程度和特异性，半定量RT-PCR可比较基因沉默的和阴性对照中转录产物的量，明确转录产物的相对减少。

3  VIGS技术的优越性和局限性

3．1 VIGS技术的优越性

由于VIGS与传统的基因功能分析方法相比，具有五个优势点[2]。①快速：VIGS能够在病毒侵染植株2~3周内引起靶基因沉默、造成表型变异，从而鉴定出靶基因的功能，不必筛选巨大的群体。而基于遗传转化的功能分析方法需要产生稳定的转基因系，周期较长。②可避免植物转化和插入突变：VIGS只需病毒载体能侵染植物、不依赖产生转基因植物，对于转化效率低、转化困难、生长周期长的植物的基因功能分析非常有利；传统的功能基因敲除、筛选过程中，对一些胚发育期必需的基因插入突变将导致致死型突变，从而得不到突变表型。但是VIGS在植物幼苗期和成熟期均可进行，因此利用VIGS对成株植物诱导产生表型突变，可以对胚发育期致死基因的功能进行研究。③克服了功能重复：对基因家族成员功能的研究中，传统的插入突变导致一个家族成员的失活，但家族的其他成员可弥补其功能，从而无法研究该家族成员的功能。VIGS是基于同源性起作用，若选取所有家族成员的高度保守区，可以沉默整个家族的成员。反之，也可选家族特异成员的特异序列，沉默该特异基因,如在拟南芥有大量的CesA基因同源序列，利用VIGS阐明了CesA-1基因功能[17]。④可以在不同遗传背景下起作用：VIGS也可用于迅速测试在某一物种不同遗传背景下某基因的功能，VIGS不受遗传背景影响，避免基因型特异效应的潜在问题，对基因功能分析更透彻[2]。传统方法产生的大多数突变群体是在单一基因型下产生的，评价不同生态型下一个突变位点需要多次回交，周期很长,而且传统方法有时会受基因型影响。⑤VIGS允许迅速比较物种间基因的功能: TRV-VIGS载体可以用于本氏烟和番茄的基因功能分析[18～20]，研究一些MAPKs和COl1在番茄抗细菌反应和本氏烟抗病毒反应中的功能[20, 21]。

3．2 VIGS的限制及其解决方法

尽管VIGS具有诸多优越性，但VIGS存在一些限制[2]。①基因沉默后没有出现期望的表型，并不能说明基因没有参与该性状。因为VIGS有时可能难以完全抑制产生目标基因表达，残量低水平的mRNA仍然有可能支撑靶基因的功能，难以观察到表型变异，其功能也难以确定。②也可能丢失基因家庭成员间功能冗余所遮盖的表型，然而此问题可能得到解决，即在进行VIGS实验前，首先利用基因组序列和大量EST数据辅助设计VIGS载体的插入序列。③ VIGS可能会不经意地抑制了高度同源的非靶基因，该问题特别是在整个基因组序列未知物种上难以避免，随着更多物种的基因组测序数据和大量EST数据的不断增加，上述非有意的共沉默的可能性将会大大降低。更重要的是，VIGS严格依赖于精确的核苷酸一致性区域而并非只根据家族关系将基因作为靶标。已有几个研究成功地沉默了基因家族的各个成员而并未影响最相近序列的转录水平，证明VIGS可以获得高度特异的基因沉默[20, 21]。 ④VIGS经常引起整个侵染植株上靶基因的不一致沉默，在植株间、实验间沉默水平也可能不同，由此复杂了对结果的解释，特别在沉默后不产生易于辨别表型的情况。解决该问题的方法之一是建立VIGS载体的内部阳性对照，用可见表型标记出沉默的区域。⑤VIGS对病原—寄主植物相互作用的依赖性也带来一些缺点，单独用病毒如PVX和TMV接种的植物可以改变植物的发育，特别是株高和叶片的形态，由基因抑制造成的细微表型变化可能会被病毒症状所掩盖，而且PVX、TMV不能侵染分生组织、不能评价在芽、叶、花和果实中发育基因的功能，然而TRV的应用会大大克服上述限制。

在基因功能研究中，VIGS的结果只是一个研究起点，可以提供一个功能信息，但并不能证明一个基因在某一生物性状中的具体含义。要想全面了解基因的功能，还需要获得功能的基因功能鉴定。然而VIGS分析基因功能的速度和简便性，意味着它在许多情况下都会成为研究基因功能的第一步。

4  利用VIGS技术进行基因功能研究的进展

    自1998年以来，VIGS已成为基因功能分析的重要工具，用于沉默在抗病、代谢、发育过程中起作用的许多基因。

4.1利用VIGS研究植物抗病途径中信号基因的功能

    VIGS最常应用的领域是研究参与植物抗病途径的已知基因、鉴定新基因。首次鉴定RAR1在抗病中作用是在大麦中通过分离突变体进行的，继后，利用VIGS证明RAR1在烟草中具相似作用[19]。用VIGS技术对烟草抗花叶病毒基因N介导的对TMV的抗性反应中重要信号基因进行了研究，结果表明EDS1、RAR1、SGT1、HSP90、SKP1、系统获得性抗性的关键调控基因NPR1、NPK1对N基因介导的抗性是必需的，编码激动素一活化蛋白激酶（MAPK）NTF6/NRK1、MAP激酶（MAPKK）MEK1与MEK2，WRKY1-WRKY3及MYB1转录因子，茉莉酸信号成分COl1的基因沉默或表达水平下降，均会降低N介导的抗病性[18,19，21～23],说明这些基因是N介导的抗病反应的正调控者。并发现SGT1在对真菌和细菌的非寄主抗性中也很重要[23]。

    利用VIGS技术在研究番茄抗病基因Pto介导的对丁香假单胞杆菌的抗性信号基因时发现热激蛋白HSP90对Pto介导的抗性是必需的[16]，MAPKs的2个激酶基因MEK1与MEK2、MAP的2个激酶基因NTF6与WIPK、NPR1和转录因子TGA1a与TGA2.2，对于Pto介导的抗性也是必需的[20,24]，RAR1与COl1在这一途径中也具微弱作用，并发现WIPK、SIPK激酶及其互作的HSP90对菊苣假单胞杆菌的非寄主抗性是正调控，但不参与INF1介导的过敏反应[25]。

    利用VIGS鉴定了蛋白磷酸化酶类型2A（PP2A）催化亚基在植物抗病反应中的功能,番茄PP2AC序列在本氏烟中实施同源基因沉默，导致防御相关基因的上调表达，同时在叶片和茎部造成局部细胞死亡、坏死，增加了抗病性，加速了抗病基因依赖信号的传递，而且，在这些植物间高度保守的PP2AC基因家族转录产物中只有靶亚基的表达水平被降低[2]。

    利用VIGS技术还研究了在N介导的对TMV抗性反应的参与基因COP9信号体。研究了在番茄对丁香假单胞杆菌的非寄生抗性的vbrboh A和B，以及Cf4和Cf9介导真菌抗性中NtCDPK2的功能[2]。

    Scofield等[26]在小麦上用BSMV-VIGS研究了RAR1、SGT1和HSP90的功能，证明RAR1、SGT1和HSP90基因在抗叶锈病基因Lr21介导的抗性中是必需的。Hein等[27]用BSMV-VIGS证明RAR1、SGT1和HSP90基因在大麦抗白粉病基因Mla13介导的抗性途径中非常重要。Faivre-Rampant等[28]用PVX做载体在马铃薯上成功地实施了VIGS，证明几个抗病及其相关基因的功能。

4.2利用VIGS技术研究代谢和发育基因 

利用VIGS技术研究了几条代谢途径[2，8，17]，包括甾醇合成，对昆虫袭击引起的茉莉酸诱导产生的抑制者和光合成的光系统Ⅱ[2]。拟南芥基因组测序结果表明，存在着大量与已知CesA基因同源基因，用VIGS技术取代传统的敲除方法在本氏烟上确定CesA-1同源物的功能，虽然CesA-1与CesA-2的核苷酸具80%同源性，VIGS仍能特异地沉默CesA-1基因，产生相应的特异表型[17]。

    VIGS有望成为研究发育参与基因功能的工具，对具发育作用的基因进行传统的敲除非常困难，因为许多突变会导致严重的致畸或致死表型，而用VIGS方法分别沉默了分生组织基因NFL[7]，花器官身份基因DEFICIENS，LEAFY和AP3等[29]，上述结果表明VIGS为研究有关植物分生组织和花器官的生长和分化的调节提供了希望，同时VIGS避免了能引起这些基因突变的消毒问题[2]。

5  展望

    VIGS有望成为植物基因功能研究和高通量功能基因组学的强有力工具，并正付诸实践，然而一些VIGS技术方面仍待开发和完善。

    VIGS 载体是VIGS技术有效实施的前提。目前最稳定和有效的VIGS载体只具有限的寄主范围，大多数基因功能是在本氏烟和茄科其它物种如番茄上进行分析的，许多重要的经济植物如水稻、大豆和棉花尚没有VIGS载体。发掘、建立更广泛寄主特别是拟南芥和水稻的有效载体非常有利于植物功能基因组学的发展。2003年报道一个水稻的VIGS新载体（F-BMV）即将释放[30]，虽然尚未见完整报道，但初步信息已表明F-BMV载体可用于评价单子叶植物的基因功能[3]。

    VIGS也应该可广泛地用于大规模筛选，以鉴定感兴趣的表型和基因序列的功能。另外，测得序列的增长和阵列TRV∷cDNA文库的发展，将允许鉴定在线数据库中感兴趣的基因并快速沉默、分析其功能。随着VIGS适用物种的增多、技术的完善以及掌握该技术的研究人员的增加，VIGS将成为基因功能研究和植物功能基因学研究的普遍利用的有力工具。

 

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