广东高州普通野生稻（Oryza rufipogon Griff.）生殖特性的研究

Ⅰ 结实率、花粉育性及其发育特点

杨培周，郭海滨，赵杏娟，李金泉，黄成达，刘向东，卢永根

（华南农业大学广东省植物分子育种重点实验室  广州  510642）

摘要：对采自6个采样点，共141个编号的高州普通野生稻的结实率、花粉育性及其发育特点进行了研究。结果发现，高州野生稻的结实率平均为57.23％，普遍偏低；花粉育性平均为89.3％。育性在50%以上的编号134个，占95.04%；7个编号出现不同程度的败育现象，败育类型以典败为主。其中育性最低的是GZW122，育性仅为8%；17个编号(占12.06%)的裂药性存在严重的异常现象。相关分析表明，花粉育性和裂药性与结实率存在极显著相关。不同采样点间存在一定的差异，其中位于祥山镇祥山村祥山洞编号的结实率、花粉育性和裂药指数都较低，变异系数却较大，显示出较丰富的多样性。利用激光扫描共聚焦显微镜术研究发现，高州普通野生稻花粉发育过程与栽培稻一致，同样经历了8个时期，即小孢子母细胞形成期、小孢子母细胞减数分裂期、小孢子早期、小孢子中期、小孢子晚期、二孢花粉期和成熟花粉期。

关键词：普通野生稻；高州；生殖特性；结实率；花粉育性；激光扫描共聚焦显微镜术

Study on the Reproductive Characteristics of Oryza Rufipogon Griff. in Gaozhou, Guangdong Province

Ⅰ Seed Setting Rate, Pollen Fertility and its Developmental Characteristics

YANG Pei-zhou，GUO Hai-bin, ZHAO Xing-juan, LI Jin-quan, HUANG Cheng-da, LIU Xiang-dong，LU Yong-gen

（Guangdong Provincial Key Laboratory of Plant Molecular Breeding, South China Agricultural University, Guangzhou 510642）

Abstract: Seed setting rate, pollen fertility and development of pollen are studied in 141 accessions of O. rufipogon Griff. collected from the six sampling sites in Gaozhou City, Guangdong Province. The results show that the seed setting rate of all accessions of the wild rice is low, with the average of 57.23%。The percentage of pollen fertility is 89.3％, in which 134 accessions (accounting for 95.04%) are of over 50%, suggesting normal fertility. The pollen fertility in 7 accessions (accounting for 4.96%) is low, in which the least was 8% (GZW122). The main abnormal sterility in pollen expresses typical sterile type. Abnormal anther dehiscence happened in 17 accessions (accounting for 12.06%). Correlation analysis shows that both anther dehiscence index and pollen fertility are the factors to affect seed setting rate. The seed setting rate, pollen fertility and anther dehiscence index are different in the wide rice in different sampling sites. Among them, Xiangshan Cave, Xiangshan County, Xiangshan Town, Gaozhou City gives the least average in the seed setting rate, pollen fertility and anther dehiscence index. However, coefficient of variation is the highest in them, which indicates the high diversity in reproduction in this site. The pollen development goes through eight stages, i.e. microsporocyte formation stage, microsporocye meiosis stage, early microspore stage, middle microspore stage, late microspore stage, early bicellular pollen stage, late bicellular pollen stage and mature pollen stage, which is similar to that in O. sativa L..

key words: O. rufipogon Griff; Gaozhou; Reproductive characteristics; Seed setting rate; Pollen fertility; Confocal laser scanning microscopy (CLSM)

野生稻是水稻种质创新的重要物质基础。野生稻共有20个种，其中分布在中国的有3个种，即普通野生稻（O. rufipogon Griff）、药用野生稻（O. officinalis Wall）和疣粒野生稻（O. meyeriana Baill）^[1～3]。普通野生稻分布面积最大，由于其与栽培稻（O. sativa  L.）的亲缘最近^[4-5]，而且具有许多极为优良的性状^[6～10]，所以一直引起研究者的重视，开展了广泛的研究，目前已取得了许多瞩目的进展，如具有突破意义的杂交稻就是利用我国普通野生稻的野败不育基因而选育成功的^[11]。由于普通野生稻拥有十分广泛的遗传多样性^[12]，许多优良基因仍有待于挖掘与利用，因而进一步开展野生稻的研究和利用具有重要的意义。

野生稻的生殖特性直接关系其繁衍，是制定保护措施的重要依据，也是采用适当方法进行基因转移的理论基础。目前涉及野生稻生殖特性的报道主要包括谷粒和花药形态^[13～15]、胚胎形态 ^[16～17]和外稃表面的乳突结构^[18]，但野生稻生殖特性的系统研究还罕见报道。由于广东省高州的普通野生稻（以下简称高州野生稻）是目前我国面积最大，保存最完好的野生稻之一^[19]。为此，本文选用通过按居群采集的141个编号的高州野生稻，结合结实率对其花粉育性及其发育特点进行系统研究，以期为保护和利用高州野生稻提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

2002年按居群从高州市辖内的6个地点选取普通野生稻。共141个单茎，按GZW001～141进行编号（见表1，以下均按编号对各单茎进行称呼）。采集的高州野生稻种植在“华南农业大学野生稻核心收集圃”里。本文实验所用的材料是利用该圃中的高州野生稻，通过离蘖分栽到大田里繁殖而成的，株行距50cm×50cm，2次重复，常规管理。

1.2 方法

1.2.1 结实率的调查

方法一：用尼龙网袋套住单株，让野生稻处于开放状态授粉。成熟时考种，统计结实率。方法二：用硫酸纸纸袋套袋，进行单株隔离授粉，成熟时考种，方法同上。

1.2.2 成熟花粉育性

抽穗时，取花药伸到顶部的颖花，投入FAA（50％乙醇:冰乙酸:甲醛＝89:6:5）固定液中固定，50%乙醇冲洗2次，复水后取花药中的花粉用2％碘-碘化钾（即I₂-KI，下同）溶液染色，普通光学显微镜下观察，计算可育和败育花粉的百分率。

1.2.3 裂药性

在开花后20min左右，参照张志胜等^[20]的方法，用放大镜观察花药裂开的情况，按照5级分类法计算裂药指数。进一步采用塑料半薄切片方法^[21]对裂药性的显微特征进行观察，具体方法是：选取裂药级别不同的花药，用FAA固定液固定，固定24h后，50%乙醇冲洗2次，梯度乙醇（70%、80%、90%、95%、100%）脱水，转入1/2 7022 Leica Histeresin （体积比7022 Leica Histeresin:95％乙醇＝1:1），在4℃冰箱中渗透24h，转入纯7022 Leica Histeresin中渗透24h，7022 Leica Histeresin 包埋，在室温下聚合。花药横切片厚度为4μm，0.01%甲苯胺蓝溶液（1%四硼酸钠溶液配制）染色。Leica DMRXA自动显微镜下观察和拍照。

表1 高州野生稻采样点的基本情况

Table 1 Basic information of sampling material of O. rufipogon in Gaozhou

* 以下各表出现的地点代号P₁，P₂，P₃，P₄，P₅和P₆与本表所示的地点相同。

* The code numbers of sites, such as P₁，P₂，P₃，P₄，P₅ and P₆ , in next other tables are the same as those in this table.

1.2.4 花粉发育特点

由于材料较多，所以本文首先采用整体染色激光扫描共聚焦显微镜术（Whole-mount stain-clearing confocal laser scanning microscopy，WCLSM）观察，参照肖波等^[22]的方法，略加改正。从孢原细胞一直到成熟花粉，以小穗长度相差1mm左右进行分组固定，每组取10个小穗，FAA固定液固定。固定24h后进行梯度乙醇（50%、30%、10%）复水，0.01g/L曙红溶液（溶于4%蔗糖溶液中）中染色，梯度乙醇（30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%）脱水，水杨酸甲酯透明。Leica SP2 激光扫描共聚焦显微镜下用543nm波长的激光激发荧光对整体花药分层扫描观察并且获取图像。此外，还辅助塑料半薄切片法（方法同1.2.3）和活体用霍夫曼法观察，霍夫曼法观察参照郭海滨^[23]的方法，在花粉发育的不同时期，挑取其中的花药放在滴有4%蔗糖溶液的载玻片上，挤压出小孢子或花粉粒，在倒置显微镜（Olympus IX-70）下用霍夫曼物镜观察花粉发育的情况并拍照。

2 结果与分析

2.1 结实率

两种套袋方法所得结实率存在明显差异，方法一所得结实率明显高于方法二。方法一的结实率变化范围为1.64～89.05％，平均为57.23％，变异系数35.13％。其中，低于50％的有40个编号，占28.37％；50～79％的有89个编号，占63.12％；80％（接近正常）以上的有12个编号，占8.51％（表2）。方法二结实率变化范围为0-52.53%，平均为13.26%，变异系数为95.25%。其中，低于50%的有140个编号，占99.29%；50～79％的只有1个编号，占0.71%。说明高州野生稻小穗育性总体上是偏低。

表 2  高州野生稻结实率

Table 2 The seed setting rate of O. rufipogon in Gaozhou

进一步对各采样点结实率分方法一和方法二分别进行统计分析（表3），表明方法一获得各采样点的结实率存在差异。其中地点P₄分布的野生稻结实率平均值最低，为40.36％；P₁、P₃和P₆的较高，分别为66.19％、65.85％和60.99％；P₂和P₅的在50％左右。方法二获得的结实率不仅低，而且变异系数大，其中，地点P₃分布的野生稻结实率平均值最低，仅4.69%；最高的为地点P₁，结实率平均值为26.22%，其他4个地点的结实率平均值基本上在10～20%范围内。

表3 高州野生稻不同采样点的结实率

Table 3 The seed setting rate among different sampling sites of O. rufipogon in Gaozhou

2.2 花粉育性

141个编号高州野生稻花粉育性平均为89.35％，变异系数19.75％。最低的编号GZW122，育性仅为8％；最高的编号GZW106，育性为99.99％。其中育性在50％以上的共有134个编号，占95.04％；在50％以下的有7个编号，占4.96％（图1）。理论上讲，水稻花粉育性在50％以上不影响授粉，所以，观察结果说明多数高州野生稻花粉育性正常（图版-1），少数编号出现部分不育现象。败育的类型与栽培稻中所出现的相似，包括典败、圆败和染败等，其中以典败为主（图版-2）。

图1 高州野生稻花粉育性分布

Fig. 1 Distribution of pollen fertility of O. rufipogon in Gaozhou

进一步分析不同地点间花粉育性（表4），表明地点P₄的花粉育性平均最低，为70.98%，且变异系数最大，为39.07%，其他5个地点花粉育性的平均值都较高。

表 4  高州野生稻不同采样点的花粉育性

Table 4  Pollen fertility among different sampling sites of O.rufipogon in Gaozhou

2.3 裂药性

141个编号高州野生稻的平均裂药指数为4.0，说明多数编号表现裂药正常，少数表现不正常。裂药指数在4.0～5.0以上，即裂药正常，表现为两端孔裂的编号有95个编号，占67.37％（图版-3）；3.0～3.9的15个，占10.64％，表现散粉基本正常，花药内剩有部分花粉（图版-4）；2.0～2.9的有14个，占9.93％，散粉差，花药只有一个裂孔；裂药指数在1.0～1.9的有17个，占12.06％，花药完全不开裂（图版-5、6）。

进一步比较不同采样点间的裂药指数（表5）。P₁和P₃的平均裂药指数都大于4.00，且变异系数很小，说明该采样点编号的花粉散粉正常。P₂、P₅和P₆的平均裂药指数都小于4.00，说明散粉基本正常。P₄的平均裂药指数较低，为3.08，变异系数为41.88％，说明该采样点多数编号散粉差，变异大。

表5 不同采样点间的裂药指数

Table 5 Anther dehiscence indexes among different sampling site

2.4 花粉发育特点的观察

高州野生稻的花粉发育过程与栽培稻一致^[21],同样经历小孢子母细胞形成期、小孢子母细胞减数分裂期、小孢子早期、小孢子中期（图版-7）、小孢子晚期、二孢花粉早期（图版-8）、二孢花粉晚期和成熟花粉期。 

2.5 结实率与花粉育性及裂药指数的相关分析

花粉育性、裂药指数与结实率的相关系数分别为3.922和10.626（t_0.01=2.612），均达到极显著水平，说明裂药性和花粉育性的降低是结实率偏低的内在原因，其中以裂药指数对结实率的影响较大。

3 讨论

3.1 高州野生稻结实率的调查

结实率是反映植物能否正常繁衍后代的重要指标。本文采用2种方法（尼龙网袋套袋和纸袋套袋）系统地对141个编号高州野生稻的结实率进行研究，一是发现多数编号的野生稻结实率偏低，如果通过种子繁殖可能存在一定障碍；二是发现通过隔离套袋，结实率明显低于开放套袋，说明野生稻异交能力强，相反，自交能力则相对较弱。野生稻异交性强一方面为创造变异性提供条件，另外也有利于通过种子繁殖；但另一方面，也带来一些问题，由于异交性可能导致野生稻与周围的栽培稻杂交，发生基因漂移，不利于保存野生稻原有的特性。

3.2 花粉育性的多样性与地理环境的关系

杨庆文等^[12]利用分子标记对4个居群的高州野生稻遗传多样性进行研究，认为居群间具有一定的相似性，又有一定程度的遗传分化。本文对高州野生稻的花粉育性进行研究，表明高州野生稻居群间的花粉育性存在一定的差异，其中以祥山镇祥山村祥山洞的花粉育性较低，该居群内的花粉育性也出现较大的差异，育性从8%～99%均有分布。该地点编号的野生稻生长在河两边的沼泽地内，三面稻田，甚至与栽培稻混杂生长，由于其柱头外露明显，容易发生串粉，所以该地点花粉异常很可能是栽野杂交导致的。其他5个采样点的野生稻一般生长在河中或者水库里，面积较大，虽然附近也有栽培稻种植，部分受到人类活动，牛食等干扰，但是由于与栽培稻相隔较远，或者有水沟和马路隔离，互相串粉的可能性很低，所以花粉育性变异也较小。

3.3 WCLSM在花粉研究上的应用

激光扫描共聚焦显微镜具有组织“CT”扫描等功能，可以在不进行切片或压片而在整体条件对组织或组织内的细胞进行观察研究，目前该仪器已广泛应用于有关花粉细胞学的研究 ^[24～28]。本研究在前人的研究上，对CLSM观察花粉作适当改进，采用WCLSM对高州野生稻的花粉发育过程进行系统研究。一方面，该法简便易行，不需切片，可以对大量野生稻材料进行研究；另一方面，可以清楚地进行花药内小孢子母细胞或小孢子的原位观察，这是普通切片法无可比拟的，值得进一步开展研究。

致谢：实验得到华南农业大学农学院徐雪宾教授和冯九焕副教授的指导以及俞淑红女士的协助。本研究中所用的激光扫描共聚焦显微镜由华南农业大学测试中心提供，并得到华南农业大学测试中心杨秉耀副教授和伦璇高级工程师的大力支持。本试验博士生李亚娟和何金华同学在论文的写作上给予许多有益建议。在此一并致谢。

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图版说明

花粉育性、裂药性和花粉发育过程

 1、2  I₂-KI染色照片，3～6塑料半薄切片, 7、8 霍夫曼法观察。

1 正常成熟花粉，GZW122 ×200。2 典败花粉，GZW117 ×200。3 完全散粉 ×200。4部分散粉，药室内有部分花粉粒（箭），GZW101 ×200。5 畸形花药，不散粉 ×200 。6不散粉花药 ×200。7小孢子中期，萌发孔出现，核（箭）位于萌发孔附近×4800。8二孢早期，细胞核分裂成营养核与生殖核和营养核×4800。

Explanation of plates

Photographs of pollen fertility ,anther dehiscence and pollen development characteristics

1、2 I₂-KI staining. 3～6 Semi-thin section. 7、8 Technique of Huffman .

1 Normal mature pollen grains, GZW122 ×200. 2 Typical sterile pollen grains, GZW117 ×200. 3 Normal anther dehiscence ×200. 4 Anther with some abnormal dehiscence. Some pollen grains（arrow） were found in endothecial cell ×200. 5 Malformed anther locule ×200. 6 Indehiscent anther ×200.  7 Microspore at middle microspore stage, the nuclei（arrow）located around the germ spore ×4800. 8 At early dyad cells,cell nuclei divided into generative cell and vegetative cell (arrow）×4800.